外泌体鉴定-NTA与DLS介绍

 1.原理

（1）NTA的核心是直接可视化并追踪单个颗粒的布朗运动。

（2）一束高度聚焦的激光束穿过样品池中的悬浮液。

（3）悬浮液中的颗粒（如外泌体）在激光束中发生光散射（或如果使用荧光模式，则发射荧光）。

（4）一个高灵敏度的摄像头（通常是CCD或CMOS）安装在显微镜上，垂直于激光路径，记录散射光点（即颗粒）的运动。摄像头以高速（通常每秒30帧或更高）捕获视频。

（5）专门的软件分析视频帧：它识别每个单独的散射光点（对应一个颗粒），并逐帧跟踪其运动轨迹（X, Y坐标随时间的变化）。

（6）根据斯托克斯-爱因斯坦方程，颗粒的布朗运动速度（由位移均方根表示）与其流体力学直径成反比。软件通过计算每个被跟踪颗粒在短时间内的平均位移，即可计算出该颗粒的粒径。

（7）统计大量颗粒（通常数百到数千个）的粒径结果，最终生成基于颗粒数量的粒径分布图和颗粒浓度（单位体积内的颗粒数）。

2.优点

（1）单颗粒分辨率：这是NTA最核心的优势。它逐个追踪颗粒，直接提供基于颗粒数量的粒径分布，能够更真实地反映样品中不同大小颗粒群体的比例。

（2）浓度测量： 能够直接测量颗粒的总浓度（颗粒数/mL），这是表征外泌体产量的关键参数。

（3）多分散性样品分析： 对于粒径分布较宽（多分散）的样品（如外泌体制品中可能同时存在小外泌体、大外泌体、少量蛋白聚集体等），NTA通常能比DLS更好地区分不同大小的群体。

（4）可视化： 操作者可以实时看到视野中的颗粒和它们的运动，有助于直观判断样品质量（如是否有大聚集体、气泡等）。

（5）荧光模式： 许多NTA仪器配备荧光模块（需要样品用荧光染料标记或表达荧光蛋白）。这使得可以特异性检测和分析带有特定表面标志物（如CD63, CD81, CD9等）的外泌体亚群，排除未标记颗粒的干扰，极大提高了分析的特异性和应用价值。

（6）分辨率： 在区分相近尺寸的颗粒群体方面，通常优于DLS。

3.缺点：

（1）样品要求高：

①纯度要求高： 对样品中的杂质（如蛋白质聚集体、脂蛋白、细胞碎片）非常敏感。杂质颗粒会被计数，导致结果偏差。样品需要高度纯化。

②浓度范围窄： 需要将样品稀释到合适的浓度范围（通常在10^7 - 10^9 颗粒/mL），以确保颗粒能被清晰分辨和追踪。浓度过高会导致颗粒重叠，无法准确追踪；浓度过低则统计量不足。

（2）操作相对复杂： 需要仔细优化样品浓度、相机设置（快门速度、增益）、分析参数等，以获得最佳结果。操作者经验对结果影响较大。

（3）测量时间较长： 为了获得足够的统计量（通常建议追踪1000个颗粒以上），每个样品通常需要录制多个（如3-5个）30-60秒的视频片段进行分析，总耗时比DLS长。

（4）成本高： NTA仪器通常比DLS仪器昂贵。

（5）小颗粒检测限： 虽然理论上可测到10nm，但在实际应用中（尤其对于散射模式），可靠检测下限通常在50-70nm左右（取决于颗粒的折光指数）。荧光模式可以改善小颗粒检测，但依赖于标记效率。

（6）不能提供Zeta电位： 标准NTA仪器不直接测量颗粒的表面电荷（Zeta电位）。

1.原理：

（1）DLS测量的是大量颗粒集体布朗运动引起的散射光强度随时间的波动。

（2）一束单色激光照射到样品池中的悬浮液上。

（3）悬浮液中的颗粒进行布朗运动，导致散射到固定检测角度的光强度不断快速波动。

（4）高灵敏度的光子检测器（如光电倍增管或雪崩光电二极管）检测这些散射光强度的快速变化。

（5）仪器计算散射光强度信号的自相关函数。该函数描述了信号与自身在不同时间延迟下的相似性。

（6）颗粒运动越快（越小），光强波动越快，自相关函数衰减越快；颗粒运动越慢（越大），光强波动越慢，自相关函数衰减越慢。

（7）通过拟合自相关函数的衰减曲线，可以计算出表征颗粒扩散快慢的扩散系数。

（8）利用斯托克斯-爱因斯坦方程，将扩散系数转换为流体力学直径。

（9）DLS给出的结果是基于散射光强的粒径分布。由于大颗粒散射光强度远大于小颗粒（光强与粒径的六次方成正比），DLS结果会强烈偏向于样品中存在的少量大颗粒或聚集体。

2.优点：

（1）快速简便： 测量非常快，通常只需几秒到几分钟即可获得结果。操作相对简单，自动化程度高。

（2）样品浓度范围宽： 对样品的浓度适应性比NTA广。对于低浓度样品，可以通过延长测量时间来获得足够信号；对于较高浓度样品（只要不发生多重散射），也能测量（但结果可能受大颗粒影响更大）。

（3）小颗粒检测潜力： 理论上可以测量到小于1nm的颗粒（如蛋白质分子），实际对于高纯度样品（如纯化蛋白），下限可达几个nm。对于外泌体（>30nm），DLS通常能检测到。

（4）测量Zeta电位： 大多数现代DLS仪器都集成了电泳光散射模块，可以方便地测量颗粒的Zeta电位（表面电荷），这对于研究外泌体的稳定性、细胞相互作用等很重要。

（5）稳定性监测： 非常适合实时监测样品粒径随时间的变化（如聚集过程），操作简单快捷。

（6）成本相对较低： 仪器购置成本通常低于NTA。

3.缺点：

（1）对多分散性敏感/大颗粒偏向性： 这是DLS最大的局限性。结果反映的是基于散射光强的平均粒径分布。样品中即使存在极少量的大颗粒或聚集体，也会显著拉高平均粒径（如Z-Average）并掩盖小颗粒群体的信息。对于像外泌体这样本身具有一定多分散性或容易混入少量杂质的样品，DLS结果可能严重失真。

（2）无法直接测量浓度： DLS不能提供颗粒的绝对浓度信息。

（3）分辨率有限： 难以精确分辨粒径分布相近或存在多个相近尺寸亚群的情况。通常只能给出一个平均粒径（Z-Average）和一个反映分布宽度的参数（多分散指数PDI）。粒径分布图的分辨率和可靠性相对较低，尤其对于多分散样品。

（4）结果解读依赖模型： 粒径分布结果是通过数学算法（如累积量法、Contin算法）对自相关函数进行反演拟合得到的。不同算法和拟合参数可能影响结果，对操作者解读有一定要求。

（5）无特异性： 标准DLS无法区分具有不同生物标志物的外泌体亚群。