外泌体研究必看——收集细胞上清用于外泌体提取那些事

收集细胞上清用于外泌体提取的方法及注意事项

1)复苏的细胞在含有血清的培养基中培养一段时间，待贴壁细胞密度达到70 %-80 %，悬浮细胞密度达到60 %-70 %；

2)对于贴壁细胞，去除原有培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次，彻底去除血清；对于悬浮细胞，300 g，4°C，10 min收集细胞，然后使用无血清培养基或者无外泌体血清培养基，孵育24-48 h，根据细胞的生长速度确定收取上清时间；

3)收集细胞上清，300 g，4°C，离心10 min，除去细胞，收好上清，再次离心3000 g，4°C，15 min，去除残余的细胞或细胞碎片；

4)取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，合并相同的细胞培养液上清样品，装入无菌容器，可在4°C短期保存(1-2天)，长期保存可冻存于-80°C。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离，保存会对产量有一定的影响。

注意事项:

1)细胞生长正常。换无外泌体血清培养基或无血清培养基后，要关注细胞密度变化，一定要有显著增长，如：从60~70%长到90~95%。如细胞无显著增殖生长，则外泌体分泌量很少，无需收样检测。也应避免细胞长得过满，导致细胞凋亡，细胞凋亡可能降解外泌体；

2)及时离心处理。收集细胞上清后，要第一时间离心去除细胞及细胞碎片，离心后的细胞上清再放到-80°C冰箱保存，避免外泌体因细胞及细胞碎片存在而导致外泌体降解；

3)无血清培养基并非指的是DMEM、1640 此类基础培养基，而是可以正常维持细胞生长的无血清替代培养基。无外泌体血清效果较佳。