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尿液外泌体收集添加剂

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尿液外泌体收集添加剂

18 人阅读发布时间：2026-04-28 10:34

尿液外泌体提取全攻略

外泌体作为细胞分泌的“纳米信使”，携带源细胞的蛋白质、RNA等生物信息，是液体活检、疾病诊断的核心研究载体。而尿液作为无创、易获取的体液样本，其外泌体（UEVs）更是泌尿系统疾病、甚至全身疾病研究的理想素材——无需侵入性采样，可反复收集，且背景蛋白干扰低，尤其适合miRNA、circRNA等非编码RNA分析。

但尿液外泌体提取过程中，样本易污染、外泌体易降解、提取效率不稳定等问题，常常困扰科研人。今天就一次性讲透：尿液外泌体的核心提取方法、必看操作注意事项，以及大家最关心的——提取时到底需要加抑菌剂？加与不加的优缺点全解析!

样品预处理：

1、晨尿：早晨 5 点至 6 点留尿（由于时间因素，一般建议 7 点左右），标本分装置于-80℃冰箱存放；

2、二次晨尿：夜尿排空后于 8 点前留取的第二次尿，标本分装置于-80℃冰箱存放；

3、清洁中段尿：尽量留取早晨第一次尿液，先用清水清洗会阴部，然后消毒会阴部和尿道口，最后用无菌干棉球擦干消毒剂，弃去开始的尿液，以冲刷尿道口的细菌。在排尿过程中，弃去前、后时段排出的尿液，采集中段尿液于无菌容器中，标本分装置于-80℃冰箱存放；

4、随机尿：受多种因素影响，特别注意的是女性应在月经期干净后 2-3 天检查避免因月经影响结果；采集时间上应避免在采集者大量服药或摄入大量体液后，标本分装置于-80℃冰箱存放；

5、24 h 尿：上午 8 时排尿一次，弃去，此后收集直至次日上午 8 时所有排出的尿液，记录总尿量，最后混匀标本后分装置于-80℃冰箱存放；

6、填写样本登记单，记录样本名称、类型、编号、取样日期等情况，干冰运输至研匠生物外泌体服务平台。

一、先搞懂：尿液外泌体核心提取方法（适配科研常用场景）

尿液外泌体浓度偏低（约0.1–0.5×10⁹ particles/mL），且受饮水量、肾功能波动影响较大，需结合样本特性选择合适提取方法，以下3种最常用，各有适配场景：

1. 超速离心法（金标准，适配科研严谨需求）

这是目前最常用、最严谨的提取方法，核心是通过梯度离心力，逐步去除尿液中的细胞、碎片、蛋白杂质，最终获得高纯度外泌体，适配Western blot、NTA粒径分析等下游实验。

2. 试剂盒提取法（高效便捷，适配常规实验）

针对科研高效需求设计，原理多为聚合物沉淀（如PEG-based方法）或亲和捕获，无需超速离心机，操作简单、耗时短，适合样本量少、新手操作，且能满足基础下游实验需求（如RNA提取、蛋白检测），是临床实验室和常规科研的优选方案。

关键步骤：尿液样本预处理（低速离心去杂质）→加

3. 超滤法（适配大体积样本，兼顾浓缩与提取）

利用超滤膜的截留作用，将尿液中的外泌体（30-150nm）与小分子杂质、游离蛋白分离，同时可实现样本浓缩（10-30倍），操作简单高效，能最大限度保留外泌体生物活性，但需注意避免膜孔堵塞导致的提取效率下降。

二、必看！尿液外泌体提取关键注意事项（避坑核心）

尿液外泌体的提取质量，直接决定下游实验成败，以下6点注意事项，少一步都可能导致实验失败，尤其新手必记：

样本收集要规范：优先收集晨尿（外泌体浓度最高，干扰最少），收集体积建议100-200ml，可满足多数下游实验需求；使用无菌容器，避免污染；收集后避免剧烈摇晃，防止外泌体膜破裂，破坏其完整性及内部 cargo 信息。
样本预处理要及时：尿液收集后需在2h内完成预处理（低速离心去杂质），若无法及时处理，需4℃冷藏（不超过12h）或-80℃冷冻保存，冷冻时需分装，避免反复冻融（反复冻融≥3次，外泌体将大量降解）；冷冻样本复苏时，需在冰上缓慢融化，不可室温快速解冻。
离心操作有讲究：超速离心时，需使用适配的厚壁离心管，平衡误差不超过0.1g，避免离心管爆破；离心温度全程控制在4℃，减少外泌体降解；离心后弃上清时，动作要轻柔，避免触碰沉淀（外泌体沉淀较松散，易丢失）；若离心后上清仍浑浊，可重复中速离心步骤，进一步去除杂质。
试剂与耗材要无菌：所有使用的试剂（PBS、裂解液等）需无菌处理，耗材（离心管、移液枪头）需一次性无菌耗材；避免使用反复回收的耗材，防止杂蛋白、微生物污染，尤其避免细菌污染导致的外泌体样本干扰。
pH与离子浓度要控制：尿液pH值波动（正常4.5-8.0）会影响外泌体稳定性，提取时可加入适量缓冲液调节pH至7.0-7.5；同时避免高盐环境，防止外泌体聚集，影响提取效率和纯度。
下游实验适配要精准：若用于RNA提取，提取过程中需加入RNase抑制剂，防止RNA降解；若用于蛋白检测，需避免使用强裂解液，防止外泌体膜破裂，导致蛋白流失；提取后的外泌体需及时用于实验，若需保存，可加入适量保护剂，-80℃冷冻保存，保存时间不超过6个月。

三、核心疑问：尿液外泌体提取，需要加抑菌剂吗？

这是科研人最常问的问题，答案不是“必须加”，也不是“不能加”，而是根据样本处理时间、实验需求决定——核心目的是抑制尿液中的细菌生长，避免细菌污染破坏外泌体，同时防止细菌自身分泌的囊泡（bEVs）干扰实验结果，以下是详细分析：

1. 什么情况下需要加抑菌剂？

当尿液样本无法及时处理（如收集后超过2h才预处理）、需要长时间冷藏（超过12h），或样本量较大、提取周期较长时，建议加入抑菌剂。因为尿液中含有少量细菌，在室温或4℃条件下，细菌会快速繁殖，不仅会降解外泌体，其分泌的bEVs还会混入样本，导致后续外泌体鉴定（如Western blot、TEM）、RNA/蛋白检测出现假阳性，甚至诱导巨噬细胞激活、细胞因子分泌异常，严重影响实验可靠性。

2. 常用抑菌剂及使用规范

科研中最常用的尿液外泌体提取抑菌剂为叠氮钠（NaN₃），其次为青霉素-链霉素混合液，使用时需严格控制浓度，避免影响外泌体活性：

叠氮钠（NaN₃）：终浓度控制在0.02%-0.05%（w/v），抑菌效果强，能有效抑制细菌、真菌生长，且对多数下游实验（如RNA提取、蛋白检测）干扰较小，是目前最推荐的抑菌剂；但需注意，叠氮钠具有毒性，操作时需佩戴手套、口罩，避免接触皮肤和呼吸道，且不可与含铜、铅的试剂混用，实验后需规范处理废液。
青霉素-链霉素混合液：终浓度为100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素，适合对叠氮钠敏感的下游实验（如细胞共培养），但抑菌谱较窄，对部分真菌无效，且长期使用可能影响外泌体蛋白活性，需谨慎选择。

此外，纯化片剂也可作为便捷的抑菌替代方案，其能有效限制上清液中的细菌数量，且不会影响外泌体的性质和完整性，可替代0.22μm过滤法，简化操作流程，尤其适合大体积尿液样本的抑菌处理。

3.加抑菌剂的优缺点（清晰对比，按需选择）

「科研小提示」：尿液外泌体提取需要规范操作、科学选择抑菌方案，才能让实验数据更具可信度哦✨

资料格式：

rcne001 外泌体提取抑菌剂-收集尿液样本.pdf

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