蛋白质免疫印迹（Western Blot ）

试剂配方：
分离胶

10%Gel 20-80KD	5ml	10ml	15ml	20ml
H2O	1.95	4.1	6.05	8.1
30%Acr	1.7	3.3	5.0	6.7
1.5M Tris-HCl-SDS (8.8)	1.3	2.5	3.8	5.0
10%APS	0.05	0.1	0.15	0.20
TEMED	0.002	0.004	0.006	0.008

浓缩胶

5%浓缩胶	4ml	5ml	6ml	8ml
H2O	2.74	3.45	4.16	5.58
30%Acr	0.67	0.83	1.0	1.4
1.5M Tris-HCl (6.8)	0.5	0.63	0.75	1.0
10%APS	0.04	0.05	0.06	0.08
TEMED	0.004	0.005	0.006	0.008

蛋白样品制备

组织中总蛋白的提取

1. 将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2. 加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。
3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
4. 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于-80℃保存。

3.蛋白含量的测定

1. 将0.5 mg/ml标准牛血清蛋白按0 μl、1 μl、2μl、4μl、8 μl、12 μl、16μl、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μl。
2. 样品用标准品稀释液稀释一定浓度后加20 μl到96孔板中。
3. 按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50:1) 配制适量BCA工作液，充分混匀，各孔加入200 μl BCA工作液，37℃放置30 min。
4. 测定562 nm处的吸光度值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。

4、SDS－PAGE电泳

1. 清洗玻璃板，灌胶与上样。
2. 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
3. 配浓缩胶。
4. 上样。
5. 电泳，电泳时间一般2-3h，电压为80 V较好，也可用100 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

5、转膜

1. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。

6、免疫反应

1. 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。

7、显影