裸鼠成瘤实验技巧

1.裸鼠的选择

实验室常用的是BALB/c-nu裸小鼠 ,随着裸小鼠年龄增长或有关因素的影响(如病毒感染),裸鼠体内正常T细胞会增加，故接种肿瘤实验一般采用4-6周龄的裸鼠。

2、裸鼠成瘤实验技巧

（1）细胞的状态是成瘤实验的关键，所以细胞生长状态一定要好，取处于对数生长期的细胞，细胞达80-90%左右密度为宜。收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。

2）胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，目的为去除细胞中残余的血清。

（3）用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般皮下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/支，接种体积为0.1-0.2ml，因此细胞悬液的浓度为1-5×10^7个细胞/ml，如若有条件的实验室，也可以加基质胶以加速瘤块的生成，基质胶与PBS或无血清的比列为1:1。

（4）细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成（如果接种量大，可以分批接种），途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢以保持细胞的活性。

（5）选择的裸鼠一般在4-6周龄，体重16-18g左右，种植部位选择血供丰富区域，如腋窝中后部。

（6）接种前用枪将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率，并且导致小鼠接种细胞数量的差异过大。

（7）接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，针头在皮下左右滑动几次，以便细胞接种成团，减少注射后细胞悬液从针眼溢出。

（8）如何保定裸鼠?左手拇指和食指捏紧裸鼠颈背部皮肤，小拇指夹住裸鼠尾巴。

（9）接种后1-2周左右可以见到皮下开始出现肿块。

（10）根据肿瘤细胞的特性和接种细胞的量，一般皮下成瘤的周期为1-2个月。肿瘤不宜生长过大，一般不要超过2000mm3。

（11）肿瘤大小测量一般为1周两次，游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位。V=1/2*a*b2 (a为长轴，b为短轴)。

（12）皮下瘤取下后一部分冻液氮用作以后提蛋白和RNA，一部分福尔马林固定用做免疫组化、免疫荧光等。

一、肿瘤长不出来的原因：

1、肿瘤生长周期很慢，一周开始生长肿块，大约需要1-2个月才能长成肿瘤。

2、细胞状态差、活力不好或是肿瘤细胞不易成瘤，加入Matrigel辅助或增大接种量或更换细胞系。

3、小鼠周龄太大，免疫功能较完善，无法成瘤。

4、小鼠免疫排斥，更换免疫缺陷程度更大的小鼠。

二、肿瘤为什么长出后又消失？

1、成瘤失败，炎症反应

实验小鼠有残留部分免疫功能，肉眼看到的“肿瘤”只是小鼠本身的炎症反应。

2、肿瘤细胞状态差

肿瘤细胞活性差或本身容易成瘤失败，建议筛选细胞时和接种前要查阅文献和检查细胞状态。

3、实验小鼠免疫力较强

如果多次实验成瘤失败，考虑更换高度免疫缺陷的实验鼠品种。

三、均一性很差，肿瘤体积差距较大？

如果荷瘤分组发现小鼠肿瘤体积差距很大，这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致，建议重新做实验分组。

四、是否可以在一只小鼠进行多个点荷瘤？

不可以，一只老鼠就只能接种一个点。因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下，可能会相互影响。