细胞传代-手把手教你养细胞

耗材及试剂

于净灭菌的培养皿、50ml离心管、15ml 离心管、1ml枪头; 1ml移 液器,镊子，马克笔;细胞适配的培养液，血清，胰酶，双抗(青霉素+链霉素)，灭菌的1xPBS

注意事项!

所有进入超净台的东西都要喷75%酒精消毒!

在超净台中进行实验时整个的过程手不可以在敞开的培养皿、管口、瓶口、枪头盒上经过!因为喷酒精消毒只喷了手套，万一从敞开的培养皿等上经过，胳膊上的菌也可能掉落造成污染。所有拧开的管盖、瓶盖、培养皿盖，正扣在台面上，不能倒扣!

原理：

细胞为什么会贴壁:贴壁细胞会分泌细胞外基质(由蛋白、多糖和其他分子组成的结构)，细胞外基质会黏附在支撑物表面(经过特殊处理的培养皿or培养瓶底部)，细胞在未贴壁时呈现球形，当细胞贴壁后，细胞逐渐伸展形成一定的上皮样or成纤维细胞样等形态。胰酶为什么能将细胞离散:胰蛋白酶是一种丝氨酸水解酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，水解细胞间的蛋白质，使贴壁细胞从皿底or瓶底脱落并分离。为什么消化后的细胞又变为球形:由于细胞自身内部骨架的张力以及培液的表面张力，消化后的细胞会变为球形，因此消化后在镜下观察.到的细胞形态是圆形的。(胰酶最佳作用条件:温度为37°C，PH=8时，胰酶作用能力最强。因此加入胰酶后我们将细胞放入孵箱消化。为了避免消化时间过长损伤细胞，会在胰酶中添加一种钙离子螯合剂-EDTA来增强胰酶的消化效果，通常选择0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA。为什么加了血清的培液可以终止消化:血清中含有蛋白，这些蛋白能够与胰酶结合，竞争性抑制从而终止消化。进入细胞房需要穿好细胞房专门的实验服，拖鞋，带好手套，口罩,保证进入超净台没有裸漏在外的皮肤。

观察细胞状态:

首先查看孵箱当中的细胞状态，打开孵箱前在手上喷75%酒精进行消毒，拿出细胞后立刻关上孵箱，孵箱不要敞开太久，会影响里面的温度湿度以及二氧化碳浓度，对细胞状态造成影响。随后在显微镜下观察细胞，密度长到90%即可进行传代操作。随后将细胞放回孵箱，先进行细胞传代的准备工作。细胞不要在外面放太久。

准备工作:

1. 提前20min将枪头盒放进超净台(枪头盒要喷75%酒精消毒后才能放进超净台，所有进入超净台的东西都要喷75%酒精消毒，包括我们 的手! )随后打开枪头盒，注意手不要经过打开的枪头盒上方。随后开紫外照超净台和枪头。

2.提前20min把需要用的培液，血清，胰酶在4°C冰箱拿出来在37°C水浴锅中预热。

3.20min后关闭紫外，将打开的枪头盒合上，将用到的东西放进超净台，用镊子撕下包裹在瓶口封口膜，用过的封口膜扔掉，随后用75%酒精浸泡过的棉花擦拭移液枪;枪头盒、胖管瘦管瓶盖边缘;培养液等瓶盖边缘以及台面。

4.在灭菌的50ml离心管中配置含血清的培液，一般血清比例为10%,具体也要看细胞系，有些细胞比较脆弱可以加到20%的血清。拧开50ml离心管盖，管盖正扣在台面上。倒入45ml加入双抗的培液，双抗加入比例一般是双抗:培液=1:100.随后加入5ml血清.

5.准备灭菌的15ml离心管，在管盖和管壁上写清细胞信息，在离心管中加入4ml含血清的培液用来终止消化。加好含血清的培液后，盖上拧紧放置在一旁备用。

细胞传代操作

1.在孵箱中取出细胞，开孵箱时手.上喷酒精，拿出细胞后立刻关闭孵箱，将细胞放进超净台，再次在手上喷酒精消毒，随后再把手放进超净台。

2.弃去培养皿中的培液(培养皿盖正扣在台子上，不能倒扣!)， 对着培养皿侧壁缓慢加入1ml 1xPBS进行润洗，洗去附着在细胞表面的 细胞碎片、死细胞以及残余的血清。加入PBS时不能 直接对着细胞吹,如果细胞贴壁性很差，会直接把细胞吹起来，对细胞造成物理伤害。

3.盖上培养皿盖，轻轻上下晃动10次左右进行润洗。随后弃去PBS, 加入胰酶，10cm大 皿一般加3ml，5cm小皿一般加1.5ml。同样，加入胰酶时不能直接对着细胞吹，对着培养皿的侧壁缓慢加入。盖上培养皿盖，将细胞放进孵箱消化。

4.消化时间根据细胞系来决定，一般隔1min左右在显微镜下观察细胞是不是消化好了，一般在显微镜下轻轻晃动培养皿看到大片细胞移动就可以了。不要过度消化!消化过度会导致细胞状态变差，不能消化到有白色絮状物出现。

5.消化好之 后，将培养皿放进超净台，轻轻吹打使皿底的细胞全部脱落下来。随后将培养皿中含有消化好细胞的胰酶加入前面准备好的加入了含血清的培养液的15ml离心管中终止消化。将含有细胞悬液的15ml离心管200rcf离心4min。

6. 等待离心的过程中准备新的培养皿，拿出新的培养皿，在皿盖.上写清细胞信息，包含名称，代数，培养人姓名，传代日期，传代比例。

7.传代比例指的是取多少消化下来的细胞加入新的培养皿中进行培养，这个要根据细胞长速来决定，比如一株细胞是1传4，培养3天可以长到90%的密度，那么就是取1/4刚刚消化下来的细胞加入新的培养皿中进行培养。

8.在新的培养皿中加入前面配置好的含10%血清的培液。在10cm大皿中加入9ml含10%血清的培液。为什么是9ml呢，因为后面还需要加入1ml 细胞悬液, 9ml 培液+1ml细胞悬液刚好补足到10ml培养体系。

9.取离心好的15ml离心管( 比如这株细胞是1传4的比例，加入4ml含10%血清的培液重悬混匀细胞后，再取1ml细胞悬液加入新的培养皿中，相当于取了1/4的细胞加六新的培养皿中)弃去上清液后，加入4ml含10%血清的培液，轻轻重悬混匀细胞，将细胞沉淀分散为单个细.胞。如果不确定是否分散为单个细胞，可以取一点点细胞悬液加入新的培养皿中在镜下观察。

10.将细胞沉淀分散为单个细胞后，取对应体积的细胞悬液加入前面 准备好的新的培养皿中，划“十”字或“米”字7-10次 将细胞混匀后，将培养皿放进孵箱即可。

培养皿:10cm皿:培养液10ml，胰酶用量2-3ml 6cm皿:培养液5ml，胰酶用量1-1.5ml . 3.5cm皿:培养液3ml，胰酶用量0.5 -1ml

培养瓶:T25:培养液6ml，胰酶用量1-2ml T75:培养液15- 20ml,胰酶用量3-4ml T175:培养液30-40ml，胰酶用量5-8ml

孔板:6孔板:培养液2ml/孔 12孔板:培养液2ml/孔 24孔板:培养液1ml/孔 96孔板:培养液100- 200ul/孔