外泌体是由细胞分泌的纳米级膜性小囊泡，直径约30~150nm。外泌体来源多样，广泛存在并分布于各种生物液体中，不同的样本收集和保存方法也不尽相同，所以本文介绍了多种外泌体样本的收集和保存方法，确保您的样本收集万无一失！

1、细胞上清

1)复苏的细胞在含有血清的培养基中培养一段时间，待贴壁细胞密度达到70 %-80 %，悬浮细胞密度达到60 %-70 %；

2)对于贴壁细胞，去除原有培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次，彻底去除血清；对于悬浮细胞，300 g，4°c，10 min收集细胞，然后使用无血清培养基或者无外泌体血清培养基，孵育24-48 h，根据细胞的生长速度确定收取上清时间；

3)收集细胞上清，300 g，4°C，离心10 min，除去细胞，收好上清，再次离心3000 g，4°C，15 min，去除残余的细胞或细胞碎片；

5)取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，合并相同的细胞培养液上清样品，装入无菌容器，可在4°C短期保存(1-2天)，长期保存可冻存于-80°C。建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离，保存会对产量有一定的影响。

注意事项:

1)细胞生长正常。换无外泌体血清培养基或无血清培养基后，要关注细胞密度变化，一定要有显著增长，如：从60~70%长到90~95%。如细胞无显著增殖生长，则外泌体分泌量很少，无需收样检测。也应避免细胞长得过满，导致细胞凋亡，细胞凋亡可能降解外泌体；

2)及时离心处理。收集细胞上清后，要**时间离心去除细胞及细胞碎片，离心后的细胞上清再放到-80℃冰箱保存，避免外泌体因细胞及细胞碎片存在而导致外泌体降解；

3)无血清培养基并非指的是DMEM、1640 此类基础培养基，而是可以正常维持细胞生长的无血清替代培养基。无外泌体血清效果较佳。

 

2、血液

选择血液提取外泌体时，不能使用全血，血清和血浆样本都可以。

全血是通过采血管采集后，经过抗凝处理的全部血液，长时间放置、冷冻或者高速离心等操作，都会使全血发生溶血，此时无法提取外泌体。血浆是经过抗凝处理的全血，进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。血清是不经过抗凝处理的血液，让它自行凝固，再进行低速离心后的上清液，为淡黄色液体。

具体血液样本操作如下：

1)采血时间一般为早晨或上午；

a、血浆：用EDTA 抗凝管(或者普通管子在取血前加入抗凝剂，不能使用肝素抗凝管）收集全血，轻柔上下颠倒混匀，室温或者4°C保存，并在1小时内进行下一步处理：

1) 4°C条件下，1900 g离心10 min，小心吸取上清即为血浆，最后 500 μl左右丢弃。

2）得到的血浆再次离心，4°C，3000 g，15 min，小心吸出血浆，注意不要碰到底部和侧面的沉淀物；

3)将血浆冻存于-80℃:

4)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

 

提示：送样量**4ml 以上(分离4 ml血浆约需要8-10 ml全血)。

b、血清：收集不加抗凝剂的全血10mL，加入到离心管或促凝管中，凝血后进行下一步离心；

2）室温静置 30 min，然后4℃条件下，静置3-4小时 (此时可见血块析出)；

3) 用移液器吸取上面的淡黄色血清(大约4 ml左右)转入15ml离心管中，4℃条件下， 3000g离心15min，小心取上清转入新的 15 ml 离心管中，**程度保证血清质量;

4)离心后的血清 15分钟内冻存于-80℃；

5)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

提示：送样量**4ml以上(分离4 ml血清约需要10-15ml全血)

 

(2)注意事项：

一定要提前做好血清或者血浆的分离，并且采血后尽快进行分离，期间不能经过冷冻，离心时转速不可太高，离心后取上清即可，发生溶血的样本应丢弃。因血液在凝血过程中血小板受到刺激会产生大量外泌体，因此若需要排除血小板外泌体的影响应采用血浆进行外泌体提取检测。

3、尿液

1)采集新鲜中段晨尿20-100 mL，加抑菌剂，并注意避免细菌污染，收集前注意对饮食的控制，于4℃临时保存(不得超过8 h) ；

2)3000 g，4°C，离心15 min，去除细胞碎片等杂质；

3)-80℃冰箱中保存；

4)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

4、唾液

1)唾液的成分会因取样的位置和时间不同而不同，在收集的时候需固定位置或是收集所有的唾液以及定时取，至少5 mL。一般建议采样1h之内不得进食和刷牙；

2)3000 g,4°C,离心15 min,去除细胞碎片等杂质;

3)-80℃冰箱中保存;

4)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

5、乳液

1)新鲜采集乳液，前2 mL左右乳液应弃去，收集至少5 mL，于4℃临时保存(不得超过8 h) ;

2)3000 g,4°C,离心15 min,去除细胞碎片等杂质;

3)-80℃冰箱中保存;

4)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

6、组织块

1)切取新鲜的组织块0.5-1 g左右，若为临床样本则按实际大小收集，装入样本冻存管中，若体积较大，需用手术刀或手术剪分割后保存；

2)-80℃冰箱中保存;

3)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

7、脑脊液

1)收集脑脊液10 mL，样本一经分离，请务必立即置于冰上或4℃短暂保存(不得超过4 h)，避免受到血液污染；

2)3000 g,4°C,离心15 min,去除细胞碎片等杂质;

3)-80℃冰箱中保存;

4)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。

8、胸水/腹水

1)收集胸水/腹水后于4℃临时保存(不得超过8 h)；

2)300 g，4°C，离心10 min，去除细胞等杂质；

3)3000 g，4°C，离心15 min，去除细胞碎片等杂质;

4)-80℃冰箱中保存；

5)记录样本名称、类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况